前段时间销售部门的同志又追加细菌基因组DNA/RNA提取试剂(磁珠法、预分装)的订单啦!询问客户需求后,实验室小组员们在马不停蹄开发优化验证新产品啦,接下来给大家分享一下实验成果。
一、实验目的
用自动核酸提取纯化仪能够成功提取细菌基因组DNA,并获得较好的电泳条带。
二、实验仪器及试剂
仪器:台式离心机(SIGMA)、超微量分光光度计(Q5000)、电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-7C型)、自动核酸提取仪(LJbio32H)
试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒(磁珠法、预分装)(货号:200866)
三、实验方法
1、样本处理:取过夜培养的细菌100~1000 μL(细胞数为108-109)至1.5 mL 离心管中10000g离心2min,吸弃上清,再加入200 μL EB重悬菌体备用。
2、按照试剂盒说明书手工操作,提取细菌基因组DNA。
3、优化自动核酸提取纯化仪的上机参数(①65℃裂解,8min ②65℃裂解,10min ③室温裂解,10min)。
4、用超微量分光光度计测量提取的DNA,并进行电泳检测。
四、实验结果
1、在超微量分光光度计上用EB润洗点点空白,取1-2 μl的洗脱产物检测,记录各个波长的吸光度,得到的数据如下:
表1 核酸提取纯化仪提取结果
序号 |
A260/A280 |
A260/A230 |
Conc(ng/μL) |
备注 |
1. |
1.98 |
1.51 |
186.6 |
65℃8min4级 |
2. |
1.95 |
1.42 |
183.7 |
|
3. |
1.92 |
1.39 |
163.3 |
65℃10min4级
|
4. |
2.02 |
1.69 |
150.1 |
|
5. |
1.76 |
0.95 |
176.9 |
室温10min4级
|
6. |
1.89 |
1.24 |
380.6 |
备注:加底纹的电泳
2、 在1%的琼脂糖凝胶上加入6μL洗脱的基因组DNA/扩增产物/DNA Marker进行电泳,结果如下:
M:DL2000Ladder
1:65℃裂解,8min;2-3: 65℃裂解,10min;4-5: 常温10min
五、分析与讨论
1、由浓度测量结果和产物电泳图可知,三种提取条件下纯度与纯度稍有差异,室温裂解条件下,电泳结果点样孔有滞留,裂解效果比其他两种稍差,但也有明显DNA带与两条RNA条带。
2、电泳图编号4 的DNA条带略暗,与测量结果也能对应起来,分析原因是提取所用耗材此孔位对应的磁棒套稍长一点,仪器提取过程中磁棒套搅拌过程中影响其裂解效果,导致此孔提取核酸测量值与电泳结果稍差。
3、对比三种程序提取效果,65℃裂解8min的测量值较均一,重复性较好,DNA条带最亮。
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